Белок – барлық ағзалардың маңызды құрамдас бөлігі. Оның әрбір молекуласы аминқышқылдарынан тұратын бір немесе бірнеше полипептидтік тізбектерден тұрады. Тіршілікке қажетті ақпарат ДНҚ немесе РНҚ-да кодталғанымен, рекомбинантты белоктар организмдерде ферментативті катализді, қорғанысты, қолдауды, қозғалысты және реттеуді қоса алғанда, кең ауқымды биологиялық функцияларды орындайды. Ағзадағы атқаратын қызметтері бойынша бұл заттарды антиденелер, ферменттер, құрылымдық құрамдас бөліктер сияқты әртүрлі категорияларға бөлуге болады. Олардың маңызды функцияларын ескере отырып, мұндай қосылыстар қарқынды түрде зерттеліп, кеңінен қолданылды.
Бұрын рекомбинантты ақуызды алудың негізгі жолы оны табиғи көзден оқшаулау болды, бұл әдетте тиімсіз және көп уақытты қажет етеді. Биологиялық молекулалық технологияның соңғы жетістіктері заттардың белгілі бір жинағын кодтайтын ДНҚ-ны бактериялар, ашытқылар, жәндіктер жасушалары және сүтқоректілердің жасушалары сияқты заттардың экспрессиялық векторына клондауға мүмкіндік берді.
Қарапайым тілмен айтқанда, рекомбинантты ақуыздар экзогендік ДНҚ өнімдері арқылы аударылады.тірі жасушалар. Оларды алу әдетте екі негізгі қадамды қамтиды:
- Молекуланы клондау.
- Белок экспрессиясы.
Қазіргі уақытта мұндай құрылымды өндіру медицина мен биологияда қолданылатын ең күшті әдістердің бірі болып табылады. Композиция зерттеулер мен биотехнологияда кең қолданылады.
Медициналық бағыт
Рекомбинантты ақуыздар қант диабеті, қатерлі ісік, жұқпалы аурулар, гемофилия және анемия сияқты әртүрлі ауруларды емдеудің маңызды әдістерін ұсынады. Мұндай заттардың типтік құрамдарына антиденелер, гормондар, интерлейкиндер, ферменттер және антикоагулянттар жатады. Терапевтік қолдануға арналған рекомбинантты препараттарға қажеттілік артып келеді. Олар емдеу әдістерін кеңейтуге мүмкіндік береді.
гендік-инженерлік рекомбинантты ақуыздар терапевтік дәрілер нарығында маңызды рөл атқарады. Сүтқоректілердің жасушалары қазіргі уақытта ең емдік агенттерді шығарады, өйткені олардың құрамдары жоғары сапалы, табиғи заттарға ұқсас заттарды шығаруға қабілетті. Сонымен қатар, жақсы генетика, жылдам өсу және жоғары өнімділік арқасында E. coli-де көптеген бекітілген рекомбинантты емдік ақуыздар өндіріледі. Сондай-ақ осы зат негізіндегі препараттарды жасауға оң әсер етеді.
Зерттеу
Рекомбинантты ақуыздарды алу әртүрлі әдістерге негізделген. Заттар организмнің негізгі және негізгі принциптерін білуге көмектеседі. Бұл молекулаларды анықтау және анықтау үшін пайдалануға боладыбелгілі бір генмен кодталған заттың орналасуын және басқа гендердің жасушалық сигнал беру, метаболизм, өсу, репликация және өлім, транскрипция, трансляция және мақалада талқыланған қосылыстардың модификациясы сияқты әртүрлі жасушалық әрекеттердегі қызметін ашу.
Осылайша, байқалатын композиция көбінесе молекулалық биологияда, жасуша биологиясында, биохимияда, құрылымдық және биофизикалық зерттеулерде және ғылымның көптеген басқа салаларында қолданылады. Сонымен бірге рекомбинантты ақуыздарды алу халықаралық тәжірибе болып табылады.
Мұндай қосылыстар жасушааралық өзара әрекеттесуді түсінуде пайдалы құрал болып табылады. Олар ELISA және иммуногистохимия (IHC) сияқты бірнеше зертханалық әдістерде тиімділігін дәлелдеді. Рекомбинантты ақуыздарды ферменттік талдауларды жасау үшін пайдалануға болады. Сәйкес антиденелер жұбымен бірге қолданғанда, жасушалар жаңа технологиялар үшін стандарт ретінде пайдаланылуы мүмкін.
Биотехнология
Құрамында аминқышқылдарының реттілігі бар рекомбинантты ақуыздар өнеркәсіпте, тамақ өндірісінде, ауыл шаруашылығында және биоинженерияда да қолданылады. Мысалы, мал шаруашылығында азық ингредиенттерінің тағамдық құндылығын арттыру, шығындар мен қалдықтарды азайту, жануарлардың ішектерінің денсаулығын қолдау, өнімділікті жақсарту және қоршаған ортаны жақсарту үшін ферменттерді тағамға қосуға болады.
Сонымен қатар, ұзақ уақыт бойы сүт қышқылы бактериялары (LAB).ашытылған тағамдарды өндіру үшін пайдаланылды және жақында LAB аминқышқылдарының реттілігі бар рекомбинантты ақуыздарды экспрессиялау үшін әзірленді, оны кеңінен қолдануға болады, мысалы, адамның, жануарлардың және тағамдық ас қорытуды жақсарту үшін.
Алайда бұл заттардың да шектеулері бар:
- Кейбір жағдайларда рекомбинантты ақуыздарды өндіру күрделі, қымбат және көп уақытты қажет етеді.
- Жасушаларда түзілетін заттар табиғи формаларға сәйкес келмеуі мүмкін. Бұл айырмашылық терапевтік рекомбинантты ақуыздардың тиімділігін төмендетіп, тіпті жанама әсерлерді тудыруы мүмкін. Сонымен қатар, бұл айырмашылық эксперимент нәтижелеріне әсер етуі мүмкін.
- Барлық рекомбинантты препараттардың негізгі мәселесі - иммуногенділік. Барлық биотехнологиялық өнімдер иммуногендіктің қандай да бір түрін көрсете алады. Жаңа емдік ақуыздардың қауіпсіздігін болжау қиын.
Жалпы, биотехнологиядағы жетістіктер әр түрлі қолданбалар үшін рекомбинантты ақуыздарды өндіруді арттырды және жеңілдетті. Олардың әлі де кемшіліктері болса да, заттар медицинада, зерттеулерде және биотехнологияда маңызды.
Ауру сілтемесі
рекомбинантты протеин адамға зияны жоқ. Бұл белгілі бір дәрілік заттың немесе қоректік элементтің дамуындағы жалпы молекуланың құрамдас бөлігі ғана. Көптеген медициналық зерттеулер семіз тышқандардың зертханалық штаммында FGFBP3 ақуызының (қысқартылған BP3) мәжбүрлеп экспрессиясы олардың дене майының айтарлықтай азайғанын көрсетті.қолдануға генетикалық бейімділігіне қарамастан масс.
Бұл сынақтардың нәтижелері FGFBP3 протеині 2 типті қант диабеті және майлы бауыр ауруы сияқты метаболикалық синдроммен байланысты бұзылулар үшін жаңа терапия ұсына алатынын көрсетеді. Бірақ BP3 жасанды дәрі емес, табиғи ақуыз болғандықтан, адамның рекомбинантты BP3 клиникалық сынақтары клиникаға дейінгі зерттеулердің соңғы раундынан кейін басталуы мүмкін. Яғни, мұндай зерттеулерді жүргізудің қауіпсіздігіне байланысты себептер бар. Рекомбинантты протеин кезең-кезеңімен өңделіп, тазартылғандықтан адамға зияны жоқ. Молекулярлық деңгейде де өзгерістер орын алуда.
PD-L2, иммунотерапияның негізгі ойыншыларының бірі физиология немесе медицина саласындағы 2018 жылғы Нобель сыйлығына ұсынылды. АҚШ-тан келген профессор Джеймс П. Аллисон және жапондық профессор Тасуку Хонджо бастаған бұл жұмыс бақылау пунктінің иммунотерапиясына негізделген меланома, өкпе рагы және т.б. ісіктерді емдеуге әкелді. Жақында AMSBIO иммунотерапия желісіне негізгі жаңа өнімді, PD-L2/TCR активаторын қосты - CHO рекомбинантты жасуша желісі.
Тәжірибелерді дәлелдеуде Бирмингемдегі Алабама университетінің зерттеушілері Х. Лонг Чжен, медицина ғылымдарының докторы, профессор Роберт Б. Адамс және UAB мектебінің патология департаменті зертханалық медицина директоры. Медицина сирек кездесетін, бірақ өліммен аяқталатын қан кету ауруының ықтимал терапиясын атап өтті, TTP.
Мұның нәтижелерізерттеулер rADAMTS13-жүктелген тромбоциттер трансфузиясы туа біткен және иммундық ТТП-мен байланысты артериялық тромбоздың жаңа және ықтимал тиімді емдік тәсілі болуы мүмкін екенін алғаш рет көрсетті.
Рекомбинантты ақуыз тек қоректік зат емес, сонымен қатар әзірленіп жатқан препараттың құрамындағы дәрілік зат. Бұл қазір медицинамен айналысатын және оның барлық құрылымдық элементтерін зерттеумен байланысты бірнеше сала ғана. Халықаралық тәжірибе көрсеткендей, заттың құрылымы молекулалық деңгейде адам ағзасындағы көптеген күрделі мәселелермен күресуге мүмкіндік береді.
Вакцинаны әзірлеу
Рекомбинантты ақуыз – модельдеуге болатын арнайы молекулалар жиынтығы. Осыған ұқсас қасиет вакциналарды жасауда қолданылады. Эдинбург университетінің және Пирбрайт институтының зерттеушілері, арнайы рекомбинантты вирус инъекциясын қолдану деп аталатын жаңа вакцинация стратегиясы тәуекелге ұшыраған миллиондаған тауықтарды ауыр респираторлық аурудан қорғай алады. Бұл вакциналар микробтарды дене жасушаларына енгізу үшін вирустың немесе бактерияның зиянсыз немесе әлсіз нұсқаларын пайдаланады. Бұл жағдайда сарапшылар зиянсыз вирустың екі нұсқасын жасау үшін вакцина ретінде әртүрлі масақ ақуыздары бар рекомбинантты вирустарды пайдаланды. Осы байланыс негізінде жасалған көптеген түрлі дәрілер бар.
Рекомбинантты ақуыздың сауда атаулары мен аналогтары келесідей:
- "Фортелизин".
- "Залтрап".
- "Эйлеа".
Бұл негізінен ісікке қарсы препараттар, бірақ осы белсенді затпен байланысты емдеудің басқа бағыттары бар.
Nature Communications ғылыми журналында жарияланған жаңа зерттеуге сәйкес, адамдарды Ласса қызбасынан да, құтырудан да қорғауға арналған LASSARAB деп аталатын жаңа вакцина клиникаға дейінгі зерттеулерде перспективалы нәтижелер көрсетті. Белсенді емес рекомбинантты вакцина үміткері әлсіреген құтыру вирусын пайдаланады.
Зерттеу тобы Ласса вирусының генетикалық материалын құтыру вирусының векторына енгізді, осылайша вакцина Лассада да, құтыру жасушаларында да беткі ақуыздарды экспрессиялайды. Бұл беттік қосылыстар инфекциялық агенттерге қарсы иммундық жауап береді. Содан кейін бұл вакцина тасымалдаушыны жасау үшін пайдаланылған тірі құтыру вирусын "жоятын" үшін инактивацияланды.
Әдістерді алу
Зат алудың бірнеше жүйесі бар. Рекомбинантты ақуызды алудың жалпы әдісі синтезден биологиялық материал алуға негізделген. Бірақ басқа жолдар бар.
Қазіргі уақытта бес негізгі өрнек жүйесі бар:
- E. coli экспрессия жүйесі.
- Ашытқы экспрессиясы жүйесі.
- Жәндік жасушаларының экспрессия жүйесі.
- Сүтқоректілердің жасуша экспрессия жүйесі.
- Жасушасыз ақуыз экспрессия жүйесі.
Соңғы нұсқа әсіресе трансмембраналық ақуыздарды экспрессиялау үшін қолайлыжәне улы қосылыстар. Соңғы жылдары кәдімгі жасушаішілік әдістермен экспрессиялануы қиын заттар in vitro жағдайында жасушаларға сәтті біріктірілді. Беларусьте рекомбинантты ақуыздарды өндіру кеңінен қолданылады. Бұл мәселемен айналысатын бірқатар мемлекеттік кәсіпорындар бар.
Жасушасыз ақуыз синтезі жүйесі – жасуша сығындыларының ферменттік жүйесінде транскрипция мен трансляцияға қажетті әртүрлі субстраттар мен энергетикалық қосылыстарды қосу арқылы мақсатты заттарды синтездеудің жылдам және тиімді әдісі. Соңғы жылдары күрделі, улы мембраналар сияқты заттардың түрлеріне арналған жасушасыз әдістердің артықшылықтары бірте-бірте пайда болды, бұл олардың биофармацевтикалық салада әлеуетті қолданылуын көрсетеді.
Жасушасыз технология кәдімгі рекомбинантты экспрессиядан кейін шешілуі қиын күрделі модификация процестеріне қол жеткізу үшін әртүрлі табиғи емес аминқышқылдарын оңай және бақыланатын түрде қоса алады. Мұндай әдістердің қолдану құндылығы жоғары және вирусқа ұқсас бөлшектерді пайдалана отырып, дәрі-дәрмек жеткізу және вакцина жасау мүмкіндігі бар. Бос жасушаларда мембраналық ақуыздардың үлкен саны сәтті экспрессияланды.
Композицияларды білдіру
Рекомбинантты протеин CFP10-ESAT 6 өндіріліп, вакциналар жасау үшін пайдаланылады. Мұндай туберкулезге қарсы аллерген иммундық жүйені нығайтуға және антиденелерді дамытуға мүмкіндік береді. Жалпы алғанда, молекулалық зерттеулер ақуыздың құрылымы, қызметі, модификациясы, локализациясы немесе өзара әрекеттесуі сияқты кез келген аспектісін зерттеуді қамтиды. Зерттеубелгілі бір заттардың ішкі процестерді қалай реттейтінін зерттеушілер әдетте қызығушылық пен пайда әкелетін функционалды қосылыстар жасау үшін құралдарды қажет етеді.
Белоктардың мөлшері мен күрделілігін ескере отырып, химиялық синтез бұл әрекет үшін қолайлы нұсқа емес. Оның орнына тірі жасушалар мен олардың жасушалық аппараттары әдетте берілген генетикалық үлгілерге негізделген заттарды жасау және құру үшін зауыт ретінде пайдаланылады. Содан кейін рекомбинантты ақуыз экспрессия жүйесі препаратты жасау үшін қажетті құрылымды жасайды. Әрі қарай әртүрлі санаттағы дәрілер үшін қажетті материалды таңдау керек.
Белоктардан айырмашылығы, ДНҚ жақсы бекітілген рекомбинанттық әдістерді қолдана отырып, синтетикалық немесе in vitro-да оңай құрастырылады. Сондықтан арнайы гендердің ДНҚ үлгілері қосылған репортер тізбегі немесе ұқсастық тег тізбегі бар немесе жоқ, бақыланатын субстанцияның экспрессиясы үшін үлгілер ретінде жобалануы мүмкін. Осындай ДНҚ үлгілерінен алынған мұндай қосылыстар рекомбинантты ақуыздар деп аталады.
Зат экспрессиясының дәстүрлі стратегиялары шаблонды қамтитын ДНҚ векторымен жасушаларды трансфекциялауды, содан кейін қажетті ақуызды транскрипциялау және аудару үшін жасушаларды өсіруді қамтиды. Әдетте, жасушалар кейіннен тазарту үшін экспрессияланған қосылысты алу үшін лизидендіріледі. CFP10-ESAT6 рекомбинантты протеині осылай өңделеді және мүмкін болатын заттардан тазарту жүйесінен өтеді.токсиндердің түзілуі. Осыдан кейін ғана ол вакцинаға синтезделеді.
Молекулалық заттар үшін прокариоттық және эукариоттық in vivo экспрессия жүйелері кеңінен қолданылады. Жүйені таңдау ақуыздың түріне, функционалдық белсенділікке қойылатын талапқа және қажетті өнімге байланысты. Бұл экспрессиялық жүйелерге сүтқоректілер, жәндіктер, ашытқылар, бактериялар, балдырлар және жасушалар кіреді. Әрбір жүйенің өзіндік артықшылықтары мен қиындықтары бар және белгілі бір қолданба үшін дұрыс жүйені таңдау қарастырылып жатқан заттың сәтті көрінісі үшін маңызды.
Сүтқоректілерден алынған өрнек
Рекомбинантты ақуыздарды қолдану әртүрлі деңгейдегі вакциналар мен препараттарды жасауға мүмкіндік береді. Ол үшін затты алудың бұл әдісін қолдануға болады. Сүтқоректілердің экспрессиялық жүйелерін жануарлар әлемінен олардың физиологиялық сәйкес ортасына байланысты ең табиғи құрылымы мен белсенділігі бар ақуыздарды өндіру үшін пайдалануға болады. Бұл трансляциядан кейінгі өңдеудің және функционалдық белсенділіктің жоғары деңгейіне әкеледі. Сүтқоректілердің экспрессиялық жүйелерін жасуша негізіндегі функционалдық талдауларда пайдалану үшін антиденелер, күрделі ақуыздар және қосылыстар жасау үшін пайдалануға болады. Дегенмен, бұл артықшылықтар неғұрлым қатаң мәдениет шарттарымен біріктірілген.
Сүтқоректілердің экспрессия жүйелерін уақытша немесе экспрессия құрылымы хост геномына біріктірілген тұрақты жасуша желілері арқылы ақуыздарды генерациялау үшін пайдаланылуы мүмкін. Мұндай жүйелер бірнеше эксперименттерде пайдаланылуы мүмкін болғанымен, уақытөндіріс бір-екі апта ішінде заттың үлкен мөлшерін құра алады. Рекомбинантты ақуыз биотехнологиясының бұл түрі жоғары сұранысқа ие.
Бұл өтпелі, жоғары өнімді сүтқоректілердің экспрессия жүйелері суспензия дақылдарын пайдаланады және литріне грамм бере алады. Бұған қоса, бұл белоктар басқа экспрессиялық жүйелермен салыстырғанда гликозилдену сияқты табиғи қатпарлану және трансляциядан кейінгі модификацияларға ие.
Жәндіктер өрнек
Рекомбинантты ақуызды өндіру әдістері тек сүтқоректілерге ғана қатысты емес. Өңделген сұйықтықтың 1 литріне шаққандағы заттың шығымы әлдеқайда төмен болғанымен, өндіріс шығындары бойынша тиімдірек жолдар да бар.
Жәндіктер жасушаларын сүтқоректілер жүйелеріне ұқсас модификациялары бар жоғары деңгейдегі ақуызды экспрессиялау үшін пайдалануға болады. Рекомбинантты бакуловирусты генерациялау үшін қолдануға болатын бірнеше жүйе бар, олар кейін жәндіктер жасушаларында қызықты затты алу үшін пайдаланылуы мүмкін.
Рекомбинантты ақуыздардың экспрессияларын оңай масштабтауға және молекулалардың кең ауқымды қосындысы үшін жоғары тығыздықтағы суспензия мәдениетіне бейімдеуге болады. Олар сүтқоректілер затының жергілікті құрамына функционалдық жағынан көбірек ұқсас. Өнімділік 500 мг/л дейін болуы мүмкін болса да, рекомбинантты бакуловирусты өндіру көп уақытты қажет етеді және культура жағдайлары прокариоттық жүйелерге қарағанда қиынырақ. Алайда, оңтүстік және жылырақ елдерде ұқсасәдіс тиімдірек деп саналады.
Бактериялық экспрессия
Бактериялардың көмегімен рекомбинантты ақуыздарды өндіруді орнатуға болады. Бұл технология жоғарыда сипатталғандардан айтарлықтай ерекшеленеді. Бактериялардың ақуызды экспрессиялау жүйелері танымал, себебі бактерияларды өсіру оңай, тез өседі және рекомбинантты формуланың жоғары өнімін береді. Дегенмен, бактерияларда көрсетілген көп доменді эукариоттық заттар көбінесе жұмыс істемейді, себебі жасушалар қажетті трансляциядан кейінгі модификацияларды немесе молекулалық қатпарларды орындау үшін жабдықталмаған.
Сонымен қатар, көптеген ақуыздар инклюзия молекулалары ретінде ерімейтін болады, оларды қатал денатураторларсыз және кейінгі күрделі молекулалық қайта қатпарлау процедураларысыз қалпына келтіру өте қиын. Бұл әдіс негізінен эксперименттік болып саналады.
Ұяшықсыз өрнек
Құрамында стафилокиназаның аминқышқылдарының тізбегі бар рекомбинантты ақуыз сәл басқаша жолмен алынады. Ол инъекциялардың көптеген түрлеріне кіреді, қолданар алдында бірнеше жүйе қажет.
Жасушасыз ақуыз экспрессиясы – трансляциялық үйлесімді тұтас жасуша сығындыларын қолданатын заттың in vitro синтезі. Негізінде, тұтас жасуша сығындыларында транскрипцияға, трансляцияға және тіпті трансляциядан кейінгі модификацияға қажетті барлық макромолекулалар мен компоненттер бар.
Бұл компоненттерге РНҚ-полимераза, реттеуші ақуыз факторлары, транскрипция формалары, рибосомалар және тРНҚ жатады. Қосқандакофакторлар, нуклеотидтер және белгілі бір ген үлгісі бар болса, бұл сығындылар бірнеше сағат ішінде қызықты ақуыздарды синтездей алады.
Кең ауқымды өндіріс үшін тұрақты болмаса да, жасушасыз немесе in vitro ақуыз экспрессиясы (IVT) жүйелері кәдімгі in vivo жүйелермен салыстырғанда бірқатар артықшылықтарды ұсынады.
Жасушасыз экспрессия жасуша культурасын қоспай-ақ рекомбинантты формулаларды жылдам синтездеуге мүмкіндік береді. Жасушасыз жүйелер белоктарды модификацияланған аминқышқылдарымен таңбалауға, сонымен қатар жасушаішілік протеазалар арқылы жылдам протеолитикалық ыдырауға ұшырайтын қосылыстарды экспрессиялауға мүмкіндік береді. Сонымен қатар, жасушасыз әдісті (мысалы, көптеген әртүрлі рекомбинантты ДНҚ шаблондарынан шағын масштабты экспрессия арқылы белок мутацияларын сынау) пайдалана отырып, көптеген әртүрлі ақуыздарды бір уақытта экспрессиялау оңайырақ. Бұл репрезентативті экспериментте IVT жүйесі адамның каспас-3 ақуызын экспрессиялау үшін пайдаланылды.
Қорытындылар және болашақ перспективалар
Рекомбинантты ақуыз өндірісін енді жетілген пән ретінде қарастыруға болады. Бұл тазарту мен талдаудағы көптеген қадамдық жақсартулардың нәтижесі. Қазіргі уақытта дәрі-дәрмектерді табу бағдарламалары мақсатты ақуызды өндіру мүмкін еместігінен сирек тоқтатылады. Бірнеше рекомбинантты заттарды экспрессиялауға, тазартуға және талдауға арналған параллель процестер қазір дүние жүзіндегі көптеген зертханаларда жақсы белгілі.
Белок кешендері және жасауда өсіп келе жатқан табысерітілген мембраналық құрылымдар сұранысты қанағаттандыру үшін көбірек өзгерістерді қажет етеді. Белоктарды тұрақты түрде қамтамасыз ету үшін тиімді келісімшарттық зерттеу ұйымдарының пайда болуы осы жаңа міндеттерді шешу үшін ғылыми ресурстарды қайта бөлуге мүмкіндік береді.
Сонымен қатар, параллельді жұмыс ағындары дәстүрлі шағын молекулалы препараттарды табу жобаларымен бірге жаңа мақсатты сәйкестендіру мен кеңейтілген скринингке мүмкіндік беру үшін бақыланатын субстанцияның толық кітапханаларын жасауға мүмкіндік беруі керек.
