Молекулярлық биологиялық зерттеу әдістері заманауи медицинада, сот сараптамасында және биологияда үлкен рөл атқарады. ДНҚ мен РНҚ зерттеудегі жетістіктердің арқасында адам ағзаның геномын зерттей алады, аурудың қоздырғышын анықтай алады, қышқылдар қоспасындағы қажетті нуклеин қышқылын тани алады және т.б.
Молекулалық биологиялық зерттеу әдістері. Бұл не?
Сонау 70-80-ші жылдары ғалымдар алғаш рет адам геномының шифрын ашуға қол жеткізді. Бұл оқиға гендік инженерия мен молекулалық биологияның дамуына серпін берді. ДНҚ мен РНҚ қасиеттерін зерттеу бұл нуклеин қышқылдарын ауруды диагностикалау, гендерді зерттеу үшін енді қолдануға болатынына әкелді.
ДНҚ және РНҚ алу
Молекулалық биологиялық диагностика әдістері бастапқы материалдың болуын талап етеді: көбінесе бұл нуклеин қышқылдары. Бұл заттарды тірі организмдердің жасушаларынан бөліп алудың бірнеше жолы бар. Олардың әрқайсысының өз артықшылықтары мен кемшіліктері бар және бұл қажеттаза нуклеин қышқылдарын бөліп алу әдісін таңдағанда ескеріңіз.
1. Мармур бойынша ДНҚ алу. Әдіс заттардың қоспасын спиртпен өңдеуден тұрады, нәтижесінде таза ДНҚ тұнбаға түседі. Бұл әдістің кемшілігі агрессивті заттарды қолдану болып табылады: фенол және хлороформ.
2. Бум бойынша ДНҚ изоляциясы. Мұнда қолданылатын негізгі зат - гуанидин тиоцианаты (GuSCN). Ол арнайы субстраттарда дезоксирибонуклеин қышқылының тұнбаға түсуіне ықпал етеді, одан кейін оны арнайы буфер арқылы жинауға болады. Дегенмен, GuSCN PTC ингибиторы болып табылады және оның тұндырылған ДНҚ-ға түсетін аз ғана бөлігі нуклеин қышқылдарымен жұмыс істеуде маңызды рөл атқаратын полимеразды тізбекті реакцияның жүруіне әсер етуі мүмкін.
3. Қоспаларды тұндыру. Әдістің бұрынғылардан ерекшелігі дезоксирибонуклеин қышқылының молекулалары емес, қоспалар тұнбаға түседі. Ол үшін ион алмастырғыштар қолданылады. Кемшілігі - барлық заттардың тұнбаға түсе алмайтындығы.
4. Жаппай скрининг. Бұл әдіс ДНҚ молекуласының құрамы туралы нақты ақпарат қажет емес, бірақ кейбір статистикалық мәліметтерді алу қажет болған жағдайларда қолданылады. Бұл нуклеин қышқылының құрылымы жуғыш заттармен, атап айтқанда сілтілермен өңделген кезде бұзылуы мүмкін екендігімен түсіндіріледі.
Зерттеу әдістерінің классификациясы
Барлық молекулалық биологиялық зерттеу әдістері үш үлкен топқа бөлінеді:
1. Күшейту (көптеген ферменттерді қолдану). Мұндакөптеген диагностикалық әдістерде үлкен рөл атқаратын ПТР – полимеразды тізбекті реакцияға жатады.
2. Күшейтпейтін. Бұл әдістер тобы нуклеин қышқылдарының қоспаларының жұмысына тікелей байланысты. Мысалдар: 3 нүкте, in situ будандастыру, т.б.
3. Белгілі бір зонд ДНҚ немесе РНҚ-мен байланысатын зонд молекуласынан сигналды тануға негізделген әдістер. Мысал гибридті түсіру жүйесі (hc2).
Молекулалық биологияны зерттеу әдістерінде қолдануға болатын ферменттер
Көптеген молекулярлық диагностикалық әдістер ферменттердің кең ауқымын қолдануды қамтиды. Төменде ең жиі қолданылатындары берілген:
1. Рестрикциялық фермент – ДНҚ молекуласын қажетті бөліктерге «кеседі».
2. ДНҚ полимераза – дезоксирибонуклеин қышқылының қос тізбекті молекуласын синтездейді.
3. Кері транскриптаза (ревертаза) – РНҚ үлгісінде ДНҚ синтездеу үшін қолданылады.
4. ДНҚ лигаза – нуклеотидтер арасындағы фосфодиэфирлік байланыстың түзілуіне жауапты.
5. Экзонуклеаза – дезоксирибонуклеин қышқылы молекуласының терминалдық бөліктерінен нуклеотидтерді жояды.
ПТР – ДНҚ күшейтудің негізгі әдісі
Полимеразды тізбекті реакция (ПТР) заманауи молекулалық биологияда белсенді түрде қолданылады. Бұл бір ДНҚ молекуласынан көптеген көшірмелерді алуға болатын әдіс (молекулалар күшейтіледі).
ПТР негізгі функциялары:
- диагностикааурулар;
- ДНҚ сегменттерін, гендерін клондау.
Полимеразды тізбекті реакцияны жүргізу үшін келесі элементтер қажет: бастапқы ДНҚ молекуласы, термотұрақты ДНҚ полимеразасы (Taq немесе Pfu), дезоксирибонуклеотид фосфаттары (азотты негіздердің көздері), праймерлер (1 ДНҚ молекуласына 2 праймер).) және барлық реакциялар мүмкін болатын буферлік жүйенің өзі.
ПТР үш қадамнан тұрады: денатурация, праймерді жасыту және ұзарту.
1. Денатурация. 94-95 градус Цельсий температурасында ДНҚ-ның екі тізбегі арасындағы сутектік байланыстар үзіліп, нәтижесінде бір тізбекті екі молекула пайда болады.
2. Праймерді күйдіру. 50-60 градус Цельсий температурасында праймерлер комплементарлылық түрі бойынша бір тізбекті нуклеин қышқылы молекулаларының ұштарына бекітіледі.
3. Ұзарту. 72 градус температурада дезоксирибонуклеин қышқылының қос тізбекті молекулаларының синтезі жүреді.
ДНҚ секвенциясы
Молекулалық биологиялық зерттеу әдістері көбінесе дезоксирибонуклеин қышқылы молекуласындағы нуклеотидтер тізбегін білуді талап етеді. Генетикалық кодты анықтау үшін секвенирлеу жүргізіледі. Болашақтың молекулярлық диагностикасы адам реттілігі бойынша алынған білімге негізделеді.
Келесі реттілік түрлері ажыратылады:
- Максам-Гилберт реттілігі;
- Сэнгер реттілігі;
- пиросеквенирлеу;
- нанокешреттілік.
