Белоктың молекулалық салмағын анықтау әдістері химиялық, физика-химиялық және физикалық болып табылады. Ең кең тараған физика-химиялық әдістер гель хроматографиясы (бағаналық және жұқа қабат) және натрий додецил сульфатының қатысуымен полиакриламидті гельдік ортадағы электрофорез. Олар күрделі жабдықты және үлкен көлемдегі сынақ материалын қажет етпейді.
Белок сипаттамасы
Белоктар - биологиялық шығу тегі жоғары молекулалық полимерлер. Олар пептидтік байланыс арқылы тізбектей байланысқан аминқышқылдарынан тұрады. Белоктардың мөлшері дәл осы аминқышқылдарының санына байланысты. Белоктардың элементтік құрамының орташа мәндері %:
- көміртек - 50, 6-54, 5 диапазонында;
- оттегі – 21,5-23,5;
- азот - шамамен 15,0-17,6;
- сутегі - 6, 5-7, 3 диапазонында;
- күкірт – 0, 3-2, 5 шегінде;
- минералды заттар - 0,5 артық емес.
Белоктар қарапайым, тек аминқышқылдарының қалдықтарынан тұратын және күрделі, соның ішінде протездік топтарға бөлінеді. Ақуыз емес компоненттер көмірсулар, липидтер, нуклеин қышқылдары, витамин туындылары, металл иондары, гем және т.б. болуы мүмкін. Төрт ақуыз құрылымы бар.
Белоктардың аминқышқылдық құрамы ион алмасу хроматографиясы арқылы бөлінген аминқышқылдарын кейіннен бөлумен біріктірілген қышқылдық гидролиз арқылы анықталады.
Аминқышқылдарының әрқайсысының сандық көрсеткіштері нингидрин әдісімен анықталады. Ақуыз молекуласындағы амин қышқылдарының орналасуын анықтау ферменттер көмегімен ақырғы амин қышқылдарын бірізді ыдырату және оларды анықтау арқылы жүзеге асырылады, бұл белок молекуласының құрылымын анықтауға мүмкіндік береді. Идентификация олардың әртүрлі физика-химиялық қасиеттеріне негізделген. Көбінесе бұл үшін белгілі бір аминқышқылдары үшін түсті реакциялар және хроматография қолданылады.
Бағаналық гель хроматографиясы
Бұл әдіс көптеген глобулярлы белоктардың молекулалық массасының логарифмінің және толтырылған гельмен (белгілі бір кеуекті өлшемдегі) элюция көлемінің сызықтық тәуелділігіне негізделген. Осылайша, ақуыздың молекулалық салмағын анықтау үшін алдын ала калибрленген колонкадан оның элюциясының көлемін ғана табу керек. Калибрлеу молекулалардың алдын ала анықталған массалары бар ақуыздарды баған арқылы өткізу және олардың әрқайсысының элюция көлемін өлшеу арқылы жүзеге асырылады. Егер толтырғыш ретінде Sephadex G-75 пайдаланылса, онда молекулалық салмақты есептеу эксперименталды түрде табылған теңдеу бойынша жүргізіледі:
lg M=5, 624 – 0, 752 (Ve / Vo), мұндағы M – қажетті молекуласалмақ; Ve – сыналатын заттың колонкадан шыққан ерітіндісінің көлемі; Vo – бос баған көлемі.
Талдау үшін көк декстран ерітіндісі (1%), NaCl ерітіндісі (0,1 моль/л), Sephadex G-75 (4 г), гемоглобин ерітіндісі (1%) қажет.
Талдау жасау
Дайын баған Sephadex G-75 гелімен толтырылып, NaCl ерітіндісімен жуылады. Гель деңгейінен жоғары көтерілген NaCl ерітіндісі ағызылғаннан кейін оның бетіне 0,5 мл көк декстран ерітіндісін мұқият салады. Содан кейін колоннадан шыққан сұйықтықтар градуирленген цилиндрге жиналады, олар тәжірибенің соңына дейін сақталады. Ағып кете бастаған көк түсті ерітіндіні алдын ала дайындалған пробиркаларға 20 тамшыдан жинайды. Олардан алынған элюат, біріншіден ең қарқынды боялғанға дейін, боялмаған фракциялар жиналған бірдей градуирленген цилиндрге құйылады. Ерітіндінің өшетін түсінің пробиркаларының көлемі есепке алынбайды.
Гладты цилиндрде жиналған сұйықтықтың көлемі колоннаның бос көлемі (Vo). Содан кейін бағанды толтыру қайталанады, бірақ көк декстриннің орнына гемоглобин ерітіндісі қолданылады. Максималды қызғылт түсті ерітінді шыққанға дейін өлшеу цилиндріндегі элюаттың көлемі Ve мәніне тең. Табылған Vo және Ve мәндері сәйкес теңдеуге ауыстырылады және ақуыз массасы есептеледі. Белоктардың аминқышқылдық құрамы ұқсас әдістермен анықталады.
Жұқа қабат гель-хроматография
Бұл әдістің принципі сефадекстің ең жұқа қабаты бар пластинадағы ақуыз ерітіндісін ілгерілету кезінде олардың қоспасы біркелкі емес таралуында жатыр. Белоктардың әрқайсысының бастапқы жолдан жүріп өткен қашықтығы бойынша олардың молекулалық салмақтарының логарифмдерін табыңыз. Жұқа қабатты гель хроматографиясы арқылы ақуыздың молекулалық салмағын анықтау үшін маркер белоктары жүріп өткен қашықтықтардың олардың молекулалық массаларының логарифміне тәуелділігін көрсететін калибрлеу графигі құрастырылады. Оны қазірдің өзінде пайдаланып, зерттелетін ақуыздың жолының ұзындығы мен оның молекуласының массасы табылды.
Тәжірибені орындау үшін айнымалы көлбеу бұрышы бар сахна, сонымен қатар хроматографиялық камера қажет. Реагенттерден сізге Sephadex G-200 немесе G-150, натрий фосфатты буфері, рН 7,4 (0,1 моль/л), бромофенол көк ерітіндісі (0,1%), CH 3ерітіндісіқажет болады. COOH (5%), CH3COONa ерітіндісі (2%), ақуыз маркер жинағы, хроматографиялық қағаз.
Экспериментті орындау
Алдымен Sephadex гелін дайындау керек, ол үшін оның 4 г құрғақ массасы натрий фосфатының буферінің артық мөлшерінде суспензияланады, содан кейін 3 күн бойы n.o. Бүйірлері 20х40 см болатын шыны табақ жақсылап жуылады. Оған Sephadex қолданбас бұрын, оның үстіндегі буфер декантацияланады, содан кейін гель жақсы араласады. Көлденең орналасқан пластинкаға фарфор қасықпен жағылады, содан кейін өлшемі 1х22 см шыны таяқшаны домалату арқылы таратады. Олтауды қалыңдығы 1 мм кесексіз және көпіршіксіз гель қабаты біркелкі тарағанша қайталайды. Дайындалған пластина ауада 15 минут кептіріледі, содан кейін хроматографиялық камераға салынады.
Фосфатты буфер сыртқы ыдыстарға құйылады, гель хроматографиялық қағазы бар буфермен біріктіріледі. Әрі қарай камера жабылып, арнайы стендке қойылады. Оның көлбеу бұрышы 7-10° болып белгіленеді. Қанықтыру үшін камераны түнде қалдырыңыз.
Молекулалық салмағы белгілі белоктардың ерітінділері, сондай-ақ зерттелетін үлгілер микропипеткамен жағылады, әрбір бөліктің көлемі 0,02 мл болуы керек. Пластина көлденең күйге қайтарылады және белгілі бір нүктелерде ақуыздың бөліктері қолданылады. Олардың арасындағы және үстіңгі жиегінен қашықтық 3 см болуы керек. Содан кейін камера жабылып, 7-10 ° бұрышта орналасады. Гель хроматографиялық талдау 4 сағат бойы жүргізіледі.
Бөлінген уақыттан кейін камера көлденең орналастырылады, хроматографиялық қағаз алынады. Шыны пластина стендке көлденең күйде орналастырылады және хроматографиялық қағазда «реплика» жасалады. Мұны істеу үшін ол түтікке оралып, жұқа гель қабатына жағылады, бірте-бірте ашылады. Бұл жағдайда қағаз оған жабысып тұруы керек, бірақ оны тұтас сақтау үшін мұны мұқият жасау керек. Қағаз пластинаның бетінде 1 минут қалдырылады, содан кейін ол 90 ° C температурада 20 минут бойы кептіріледі. және арнайы бояу табаға салыңыз.
Нәтижелердің транскрипциясы
Белок аймақтарын анықтау үшін «репликаны» 3 минутқа бромфенол көк ерітіндісіне салады. Әрі қарайбояуды екі рет сірке қышқылының ерітіндісімен жуып, натрий ацетатымен бекіту керек. Осыдан кейін хроматографиялық қағазды суық ағынды суда жақсылап жуып, кептіреді. Содан кейін олар әр ақуыздың бастапқы нүктеден нүктенің ортасына дейінгі аралығын өлшей бастайды.
Алынған деректерге сәйкес, калибрлеу графигі абсцисса осі бойынша сызу арқылы құрастырылады lа/lst (мұнда a индексі талданғанға, ал st – стандартты ақуызға), у осі бойынша – lgM. Сынақ үлгісінің белок аймағының басынан бастап қашықтығын өлшеу арқылы белок молекуласының молекулалық салмағы мен ұсынылған құрылымы сызылған график арқылы анықталады.
