Бейорганикалық және органикалық орталар арқылы жарықты сіңіру және одан әрі қайта шығару фосфоресценция немесе флуоресценцияның нәтижесі болып табылады. Құбылыстар арасындағы айырмашылық жарықтың жұтылуы мен ағынның сәулеленуі арасындағы аралық ұзақтығы болып табылады. Флуоресценцияда бұл процестер дерлік бір мезгілде және фосфоресценциямен біршама кідіріспен жүреді.
Тарихи дерек
1852 жылы ағылшын ғалымы Стокс флуоресценцияны алғаш рет сипаттады. Ол жаңа терминді ультракүлгін сәулелер әсер еткенде қызыл жарық шығаратын флюоршпаттармен жүргізген тәжірибелерінің нәтижесінде ойлап тапты. Стокс қызықты құбылысты атап өтті. Ол флуоресцентті жарықтың толқын ұзындығы қоздыру жарығынан әрқашан ұзын болатынын анықтады.
19 ғасырда гипотезаны растау үшін көптеген эксперименттер жүргізілді. Олар ультракүлгін сәулелердің әсерінен әртүрлі үлгілердің флуоресцентті болатынын көрсетті. Материалдарға, сонымен қатар, кристалдар, шайырлар, минералдар, хлорофилл,дәрілік шикізат, бейорганикалық қосылыстар, витаминдер, майлар. Бояғыштарды биологиялық талдау үшін тікелей қолдану 1930 жылы ғана басталды
Флуоресцентті микроскоптың сипаттамасы
20 ғасырдың бірінші жартысындағы зерттеулерде пайдаланылған кейбір материалдар өте нақты болды. Контрасты әдістермен қол жеткізу мүмкін болмаған көрсеткіштердің арқасында флуоресцентті микроскопия әдісі биомедициналық және биологиялық зерттеулерде маңызды құрал болды. Алынған нәтижелер материалтану үшін маңызды болды.
Флуоресцентті микроскопияның қандай пайдасы бар? Жаңа материалдардың көмегімен жоғары спецификалық жасушалар мен субмикроскопиялық компоненттерді оқшаулау мүмкін болды. Флуоресцентті микроскоп жеке молекулаларды анықтауға мүмкіндік береді. Түрлі бояулар бір уақытта бірнеше элементтерді анықтауға мүмкіндік береді. Жабдықтың кеңістіктік рұқсаты дифракция шегімен шектелгенімен, бұл өз кезегінде үлгінің ерекше қасиеттеріне байланысты, бұл деңгейден төмен молекулаларды анықтау да әбден мүмкін. Әртүрлі үлгілер сәулеленуден кейін автофлуоресценцияны көрсетеді. Бұл құбылыс петрологияда, ботаникада, жартылай өткізгіш өнеркәсібінде кеңінен қолданылады.
Мүмкіндіктер
Жануарлардың тіндерін немесе патогенді микроорганизмдерді зерттеу көбінесе тым әлсіз немесе өте күшті спецификалық емес автофлуоресценциямен қиындайды. Дегенмен, мәнзерттеу белгілі бір толқын ұзындығында қозғалатын және қажетті қарқындылықтағы жарық ағынын шығаратын компоненттерді материалға енгізуді алады. Фторхромдар құрылымдарға (көрінбейтін немесе көрінетін) өздігінен қосылуға қабілетті бояғыштар ретінде әрекет етеді. Сонымен бірге олар мақсаттарға және кванттық кірістілікке қатысты жоғары селективтілігімен ерекшеленеді.
Флуоресцентті микроскопия табиғи және синтетикалық бояғыштардың пайда болуымен кеңінен қолданыла бастады. Олардың арнайы шығарындылары мен қозу қарқындылығы профильдері болды және нақты биологиялық мақсаттарға бағытталған.
Жеке молекулаларды анықтау
Көбінесе тамаша жағдайларда бір элементтің жарқылын тіркеуге болады. Мұны істеу үшін, басқалармен қатар, детектордың жеткілікті төмен шуын және оптикалық фонды қамтамасыз ету қажет. Флуоресцеин молекуласы фотоағарту салдарынан жойылу алдында 300 000 фотонға дейін шығара алады. 20% жинау жылдамдығымен және процестің тиімділігімен оларды шамамен 60 мың
көлемінде тіркеуге болады.
Көшкін фотодиодтарына немесе электронды көбейтуге негізделген флуоресцентті микроскоп зерттеушілерге жекелеген молекулалардың әрекетін секундтар, ал кейбір жағдайларда минуттар бойы бақылауға мүмкіндік берді.
Қиындықтар
Негізгі мәселе – оптикалық фонда шуды басу. Сүзгілер мен линзаларды жасауда қолданылатын көптеген материалдардың кейбір автофлуоресценцияға ие болуына байланысты ғалымдардың күш-жігері бастапқы кезеңдердефлуоресценциясы төмен компоненттер. Дегенмен, кейінгі тәжірибелер жаңа тұжырымдарға әкелді. Атап айтқанда, толық ішкі шағылыстыруға негізделген флуоресцентті микроскопияның төмен фондық және жоғары қоздырғыш жарық шығаруға қол жеткізуі анықталды.
Механизм
Толық ішкі шағылысуға негізделген флуоресцентті микроскопияның принциптері тез ыдырайтын немесе таралмайтын толқынды пайдалану болып табылады. Ол әртүрлі сыну көрсеткіштері бар орталар арасындағы интерфейсте пайда болады. Бұл жағдайда жарық сәулесі призма арқылы өтеді. Оның сыну көрсеткіші жоғары.
Призма сулы ерітіндіге немесе төмен параметрлі шыныға жақын орналасқан. Егер жарық сәулесі оған критикалық бұрыштан үлкен бұрышпен бағытталса, сәуле интерфейсінен толығымен шағылысады. Бұл құбылыс, өз кезегінде, таралмайтын толқынды тудырады. Басқаша айтқанда, 200 нанометрден аз қашықтықта сыну көрсеткіші төмен ортаға енетін электромагниттік өріс пайда болады.
Таралмайтын толқында жарық қарқындылығы флюорофорларды қоздыру үшін жеткілікті болады. Дегенмен, оның тереңдігі өте аз болғандықтан, оның көлемі өте аз болады. Нәтиже - төмен деңгейлі фон.
Модификация
Толық ішкі шағылысуға негізделген флуоресцентті микроскопияны эпи-жарықтандыру арқылы жүзеге асыруға болады. Бұл үшін сандық апертурасы жоғары линзалар қажет (кем дегенде 1,4, бірақ оның 1,45-1,6 жеткені жөн), сондай-ақ аппараттың жартылай жарықтандырылған өрісі. Соңғысы кішкентай дақпен қол жеткізіледі. Үлкен біркелкі болу үшін жұқа сақина қолданылады, ол арқылы ағынның бір бөлігі бітеліп қалады. Толық шағылысу орын алатын критикалық бұрышты алу үшін линзалардағы және микроскоптың қақпағы әйнегіндегі батыру ортасының сынуының жоғары деңгейі қажет.
