ДНҚ будандастыруының негізінде не жатыр? Екі тізбекті ДНҚ тізбегі әдетте физиологиялық жағдайларда тұрақты болғанымен, бұл жағдайларды зертханада өзгерту (әдетте қоршаған орта температурасын көтеру арқылы) молекулалардың жеке тізбектерге бөлінуіне әкеледі. Соңғылары бір-бірін толықтырады, бірақ олардың ортасында бар басқа тізбектерді де толықтыра алады. Қоршаған ортаның температурасын төмендету бір тізбекті молекулалардың бір-бірімен күйдірілуіне немесе «гибридтенуіне» мүмкіндік береді. Бұл ДНҚ будандастыру әдісі.
Молекулалық биология тұрғысынан тұжырымдама
ДНҚ репликациясына да, ДНҚ-ның РНҚ-ға транскрипциясына да қатысатын ғалымдар нуклеотидтердің кроссоверіне және молекулалық биология әдістеріне сүйенеді. Бұған оңтүстік және солтүстік дақтар, полимеразды тізбекті реакция (ПТР) және ДНҚ-РНҚ гибридизациясы мен секвенирлеу тәсілдерінің көпшілігі кіреді.
Қолданба
Гибридтену нуклеотидтің негізгі қасиетіреттілігі және молекулалық биологияның көптеген әдістерінде қолданылады. Екі түрдің жалпы генетикалық байланысын олардың ДНҚ сегменттерін будандастыру (ДНҚ-ДНҚ будандастыру) арқылы анықтауға болады. Бір-бірімен тығыз байланысты организмдер арасындағы бірізділік ұқсастықтарына байланысты алыстағы организмдермен салыстырғанда мұндай ДНҚ будандарын балқыту үшін жоғары температура қажет. Полимеразды тізбекті реакцияны (ПТР) қоса, ДНҚ үлгісінің шығу тегін анықтау үшін әртүрлі әдістер будандастыруды пайдаланады. Басқа әдісте қысқа ДНҚ тізбегі экспрессияланған гендерді анықтау үшін жасушалық мРНҚ-ға гибридтенеді. Фармацевтикалық компаниялар рибосоманың мРНҚ-ны ақуызға айналдыруына жол бермей, қажетсіз мРНҚ-мен байланысу үшін антисенс РНҚ-ны қолдануды зерттеп жатыр.
ДНҚ-ДНҚ будандастыру әдетте ДНҚ тізбектерінің пулдары арасындағы генетикалық ұқсастық дәрежесін өлшейтін молекулалық биология әдісіне жатады. Ол әдетте екі организм арасындағы генетикалық қашықтықты анықтау үшін қолданылады. Ол филогения мен таксономияда кеңінен қолданылды.
Әдістеме
Бір ағзаның ДНҚ-сы таңбаланған, содан кейін онымен салыстыруға болатын таңбаланбаған ДНҚ-мен араласқан. Қоспа ДНҚ жіптерінің диссоциациялануына мүмкіндік беру үшін инкубацияланады, содан кейін регенерацияланған гибридті қос тізбекті ДНҚ қалыптастыру үшін суытады. Ұқсастық дәрежесі жоғары гибридтелген тізбектер тығызырақ байланысады және оларды бөлу үшін көбірек энергия қажет болады: яғни олар жоғары температурада қыздырылғанда бөлінеді.температура ұқсас емес тізбектерге қарағанда, бұл процесс "ДНҚ балқуы" деп аталады.
ДНҚ-ның балқуы
Гибридтелген ДНҚ-ның балқу профилін бағалай отырып, қос тізбекті ДНҚ «баған» деп аталатын бөлікпен байланысады және алынған қоспаны қыздырады. Әрбір қадамда баған жуылады және балқыған ДНҚ тізбегі бір тізбекке айналады және бағананы жуып тастайды. Белгіленген ДНҚ бағаннан шығатын температуралар реттіліктер арасындағы ұқсастық мөлшерін көрсетеді (және өздігінен жиналатын үлгі бақылау ретінде қызмет етеді). Бұл нәтижелер организмдер арасындағы генетикалық ұқсастық дәрежесін анықтау үшін біріктірілген. Заманауи микробиологияға сәйкес, бұл нәрселерді түсінбей, ДНҚ будандастыру мүмкін емес.
Рибонуклеин қышқылының (немесе дезоксирибонуклеиннің) қышқылдарының бірнеше түрін осылай салыстырған кезде ұқсастық мәндері түрлерді филогенетикалық ағашқа орналастыруға мүмкіндік береді. Сондықтан бұл молекулалық систематиканы жүргізудің мүмкін болатын тәсілдерінің бірі. Чарльз Сибли мен Джон Ахлквист, бұл әдістің бастаушылары, құстардың (Сибли-Ахлквист таксономиясы) және приматтардың филогенетикалық байланыстарын зерттеу үшін ДНҚ-ДНҚ будандастыруын қолданды.
Биология үшін маңызы
ДНҚ-ДНҚ гибридизациясы бактериалды түрлерді ажыратудың алтын стандарты болып табылады, ұқсастық мәні 70%-дан астам, бұл салыстырылған штаммдардың әртүрлі түрлерге жататынын көрсетеді. 2014 жылы бактериялық кіші түрді бөлу үшін 79% ұқсастық шегі ұсынылды.
Сыншылар бұл әдіс бір-біріне жақын түрлерді салыстыру үшін дәл емес деп санайды, өйткені организмдер арасындағы ортоологиялық реттіліктер арасындағы айырмашылықтарды өлшеуге кез келген әрекет организмнің геномындағы паралогиялық аналогтардың будандастырылуынан асып түседі. ДНҚ секвенциясы және есептеу тізбегін салыстыру қазіргі уақытта генетикалық қашықтықты анықтаудың жиі қолданылатын әдісі болып табылады, дегенмен бұл әдіс бактерияларды анықтауға көмектесу үшін микробиологияда әлі де қолданылады.
Қазіргі әдіс - толық немесе ішінара реттелген геномдарды пайдалана отырып, силикондағы ДНҚ-ДНҚ будандастыруын жүргізу. DSMZ әзірлеген GGDC DDH ұқсас мәндерді есептеуге арналған ең дәл белгілі құрал болып табылады. Басқа алгоритмдік жақсартулардың қатарында ол екі геном тізбегі арасындағы сәйкестіктен мұқият сүзгілеу арқылы паралогтық тізбектермен мәселені шешеді.
БАЛЫҚ әдісі
Флуоресценция In Situ будандастыру (FISH) – көбінесе белгілі бір хромосомадағы ДНҚ-ны анықтау және ретін келтіру үшін қолданылатын зертханалық әдіс.
1969 жылы Джозеф Галл мен Мэри Лу Парду рибосомалық ДНҚ тізбегінің радиоактивті көшірмелерін бақа жұмыртқасының ядросындағы комплементарлы ДНҚ тізбегін анықтау үшін пайдалануға болатынын көрсететін мақала жариялады. Осы бастапқы бақылаулардан бері көптеген нақтылаулар жан-жақтылықты арттырды жәнепроцедураның сезімталдығы соншалық, in situ будандастыру («орнында», латын) қазір цитогенетикадағы маңызды құрал болып саналады. (Қазір in situ термині патологиялық процеске тек эпителий ұлпасы қатысатын карцинома өсуінің бастапқы кезеңіне қатысты қолданылады.)
Флуоресцентті будандастыру реті
РНҚ зондтары ұлпалар мен жасушалардағы lncRNA және miRNA мРНҚ-ны визуализациялау үшін кез келген генге немесе гендегі кез келген реттілікке арналған. FISH жасушаның көбею циклін, атап айтқанда, кез келген хромосомалық ауытқулар үшін ядролық интерфазаны зерттеу арқылы қолданылады. FISH мұрағаттық істердің үлкен сериясын талдауға мүмкіндік береді, ұқсас хромосомаларды тартатын жасанды хромосома негізі бар зонд жасау арқылы анықталған хромосоманы анықтау оңайырақ.
Ядролық аномалия анықталған кезде әрбір зонд үшін гибридтеу сигналдары: әрбір mRNA және lncRNA анықтау зондтары 20 жұп олигонуклеотидтерден тұрады, әрбір жұп 40-50 bp кеңістігін қамтиды. б. Зондтар мРНҚ анықтау үшін меншікті химияны пайдаланады.
ДНҚ зондтарымен будандастыру
Зондтар көбінесе адам геномын жобалауда пайдалану үшін оқшауланған, тазартылған және күшейтілген ДНҚ фрагменттерінен жасалады. Адам геномының өлшемі тікелей тізбектеуге болатын ұзындықпен салыстырғанда өте үлкен, сондықтан оны екіге бөлу керек.фрагменттері. Сайып келгенде, бұл фрагменттер үлкен фрагменттердің қай жерде бір-бірімен қабаттасатынын анықтау үшін осы ақпаратты пайдалана отырып, өлшемді алып тастау хроматографиясы арқылы әрбір кішкене фрагменттің өлшемін өлшеу үшін реттілікке тән эндонуклеазаларды пайдалана отырып, әрбір фрагменттің көшірмесін одан да кішірек бірліктерге қорыту арқылы реттелген..
Элементтерді жеке ДНҚ тізбегімен сақтау үшін фрагменттер үнемі қайталанатын бактериялар популяциясы жүйесіне қосылды. Бактериялардың клондық популяциялары, әрбір популяция бір жасанды хромосоманы сақтайды, дүние жүзіндегі әртүрлі зертханаларда сақталады. Жасанды хромосомаларды (BAC) кітапханасы бар кез келген зертханада өсіруге, алуға және таңбалауға болады. Геномдық кітапханалар көбінесе олар дамыған мекемелердің атымен аталады. Мысал ретінде Буффалодағы (Нью-Йорк, АҚШ) Розуэлл қатерлі ісік институтының атымен аталған RPCI-11 кітапханасын келтіруге болады. Бұл фрагменттер шамамен 100 мың негізгі жұпты құрайды және FISH зондтарының көпшілігінің негізі болып табылады.
